流式細(xì)胞術(shù)

樣本處理：取100-200 μL全血或單細(xì)胞懸液（細(xì)胞量10?-10?），加入抗體后室溫避光孵育15-30分鐘。

裂紅處理：若樣本含紅細(xì)胞，需加入溶血素（如BD FACS? Lysing Solution），室溫避光孵育10分鐘并震蕩。

洗滌與離心：用染色緩沖液或PBS洗滌2次（300×g離心5分鐘），去除未結(jié)合抗體。

多色標(biāo)記策略：建議聯(lián)用CD3/CD4/CD8抗體，并結(jié)合CD45RO區(qū)分T細(xì)胞亞群（如CD45RA+為原始T細(xì)胞，CD45RO+為記憶T細(xì)胞）。

2. 免疫組化（IHC）

組織處理：使用石蠟包埋或甲醛固定組織，脫蠟后通過二甲苯或梯度乙醇清洗。

抗體孵育：濃縮抗體推薦稀釋比例1:200，室溫孵育30分鐘，無需抗原修復(fù)。

陽性對照：扁桃體組織可作為膜定位的陽性對照。

注意事項：

藍(lán)色熒光染料（如CF?405S）不適用于低豐度靶標(biāo)檢測，可能增加背景。

熒光偶聯(lián)抗體需避光保存，避免反復(fù)凍融。

樣本預(yù)處理

全血/體液：離心（1000×g，20分鐘）去除細(xì)胞碎片，保留上清。

組織樣本：需充分脫蠟和固定，避免抗原損失。

洗滌步驟

流式細(xì)胞術(shù)：每管加2 mL洗滌液，靜置1分鐘后離心，重復(fù)5次。

免疫組化：每步用PBS清洗切片，徹底去除未結(jié)合抗體。

ELISA：洗滌緩沖液需預(yù)熱至室溫，洗板后徹底拍干，避免殘留液體影響OD值。

裂解與封閉

裂紅后需用染色緩沖液重懸細(xì)胞，防止細(xì)胞聚集。

使用5% BSA或同源血清封閉非特異性結(jié)合位點。

封閉策略

血清封閉：使用與二抗同源的血清（如山羊血清）封閉Fc受體。

BSA/Triton-X：添加0.1-0.5% Triton-X增強疏水區(qū)域封閉效果。

優(yōu)化條件

抗體濃度：通過預(yù)實驗確定最佳稀釋比例，降低非特異性結(jié)合。

洗滌強度：增加洗滌次數(shù)（5次以上）并延長浸泡時間（30秒/次）。

內(nèi)源干擾處理

過氧化物酶阻斷：使用含H?O?的緩沖液處理肝、腎等高內(nèi)源酶組織。

生物學(xué)差異

CD45RA：表達(dá)于原始T細(xì)胞（未致敏）、B細(xì)胞及部分單核細(xì)胞，分子量205-220 kDa。

CD45RO：表達(dá)于記憶T細(xì)胞（已激活），分子量180 kDa，與CD45RA互補且非重疊。

實驗聯(lián)用方案

T細(xì)胞分群：聯(lián)用CD3/CD4/CD8抗體，結(jié)合CD45RA/RO區(qū)分原始與記憶亞群。

淋巴瘤鑒別：CD45RA+多見于B細(xì)胞淋巴瘤，CD45RO+常見于T細(xì)胞淋巴瘤。

多色熒光搭配

背景過高：檢查封閉劑有效性，或嘗試更換低交叉反應(yīng)性二抗。

信號弱：優(yōu)化抗體濃度，延長孵育時間至45分鐘。

細(xì)胞聚集：使用含EDTA的緩沖液，或增加離心前靜置時間。